Энистон родилась 11 февраля 1969 года в городке Шерман-Окс (штат Калифорния, США) в семье американского актёра греческого происхождения Джона Энистона (урождённый Яннис Анастассакис, родом с острова Крит) и Нэнси Доу (1936—2016), актрисы с шотландскими и итальянскими корнями. У Дженнифер есть два брата — Джон Мелик (старший) и Алекс Энистон (младший). Крёстный отец Энистон — греко-американский актёр Телли Савалас, лучший друг её отца. Её дед (по фамилии Анастассакис) приехал в США из Греции и стал владельцем закусочной.
Энистон училась в штайнеровской школе в Нью-Йорке. В школьном драматическом кружке проявился её актёрский талант. В этой же школе проявились и её способности к рисованию.
Когда девочке было 9 лет, её родители развелись. Она осталась с матерью, но часто ездила к отцу в Лос-Анджелес, где Джон Энистон играл одну из главных ролей в сериале «Дни нашей жизни». В 11 лет Дженнифер начала играть в драматическом кружке школы Рудольфа Штайнера. Своё профессиональное обучение она продолжила в 1987 году в нью-йоркской школе искусств LaGuardia, после окончания которой приняла участие в нескольких бродвейских постановках («For Dear Life», «Dancing on Checker's Grave» и др.). В этот период Энистон также подрабатывала курьером и занималась телефонным маркетингом