В 1993 году была избрана в первый состав Совета Федерации ФС РФ, где и проработала до избрания 17 декабря 1995 года депутатом Госдумы РФ.
В 1996—2003 годах — депутат ГД ФС РФ II—III созывов, член фракции «Яблоко» (1995—2001), фракции «Союз правых сил» (2001—2003). Осуществляла юридическое оформление несостоявшегося импичмента президенту Ельцину в 1999 году.
В 2004—2007 — представитель Государственной Думы в Конституционном суде, в этом качестве отстаивала в 2005 году правомерность решения об отмене прямых губернаторских выборов в России.
В 2007 году была избрана депутатом ГД ФС РФ V созыва, была членом фракции «Справедливая Россия», председателем Комитета ГД по вопросам семьи, женщин и детей.
В 2011 году избрана депутатом Государственной думы ФС РФ VI созыва, член фракции «Справедливая Россия», председатель Комитета ГД по вопросам семьи, женщин и детей.
Является одним из авторов Федерального закона № 139-ФЗ от 28 июля 2012 года (бывш. Законопроект № 89417-6)[2], получившего известность как «закон о чёрных списках» или «закон о цензуре в Интернете», а также принятого в 2010 году закона «О защите детей от информации, причиняющей вред их здоровью и развитию», с которым его часто путают.
10 июля 2012 года заявила, что подаст запрос в министерство юстиции США с целью проверить забастовку русской Википедии, так как считает, что в законопроекте № 89417-6 цензуры нет; тогда же предположила, что за протестами в Интернете стоит педофильское лобби.
14 ноября 2012 года Мизулина заявила, что профилактическая цель закона 139-ФЗ — без применения наказания добиться безопасной информационной среды — достигнута. Также заявила, что возможно будет разработан еще один законопроект, который запретит доступ к сайтам, позволяющим просматривать страницы, внесенные в единый реестр запрещённых сайтов. Среди таких порталов, противодействующих черному списку был назван rublacklist.net, принадлежащий пиратской партии России.
В июне 2013 года Комитет Госдумы по делам семьи, который возглавляет Мизулина, обнародовал проект «Концепции государственной семейной политики до 2025 года», где предлагается ввести дополнительный налог на развод, осуждается рождение ребёнка вне брака, предлагаются новые ограничения на аборты, резко осуждается гомосексуализм. Обновременно предлагается усилить роль церкви в принятии семейных законов, увеличить количество «многопоколенных» семей (семьи где вместе живут бабушки, дедушки, дети и внуки), рекомендуется активно пропагадировать многодетность, и установить минимальный размер алиментов, выплата которых не должна зависеть от наличия или отсутствия дохода у родителя. Александр Никонов и другие оппозиционные журналисты высказали предположение что развод Путина, состоявшийся через два дня после опубликования этого законопроекта, связан с предлагаемым в нём введением нового штрафа за развод. Отвечая в интервью «Эхо Москвы» на вопрос о её отношении к разводу Путина, Мизулина сказала: «Никакого расхождения поведение супругов Путиных с проектом концепции государственной семейной политики, который я презентовала на координационном совете по реализации национальной стратегии действий в интересах детей, нет. ... на мой взгляд, они подали пример цивилизованного развода, уважения друг к другу и сохранения по отношению друг к другу личных обязательств и заботы, если вдруг тем более что случится.»
В июне 2013 публицист Альфред Кох опубликовал статью о том что сын Мизулиной работает в Бельгии, в крупной международной юридической фирме Mayer Brown, спонсирующей гей-организации и находящейся в сотне главных организаций защищающих права членов ЛГБТ-сообщества в Бельгии, несмотря на то что его мать Мизулина активно борется с гомосексуалистами в России. В ответ Мизулина обвинила Коха в принадлежности к «педофильскому лобби».
